初級檢驗(yàn)技士考試輔導(dǎo):血小板計(jì)數(shù)的參考方法

　　1、范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血小板計(jì)數(shù)參考方法的技術(shù)要求。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于建立血小板計(jì)數(shù)參考方法的實(shí)驗(yàn)室。

　　2、規(guī)范性引用文件

　　國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)-2001血小板計(jì)數(shù)的參考方法

　　3、定義

　　參考方法(Referencemethod)

　　一種可清楚和準(zhǔn)確描述的用于特定檢測的技術(shù)，該技術(shù)要有依據(jù)，可提供足夠準(zhǔn)確和精密的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以評價(jià)其他實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準(zhǔn)確性必須與決定性方法進(jìn)行比較。參考方法應(yīng)溯源至一級計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)并且須標(biāo)示不準(zhǔn)確度和不精密度。

　　4、總則

　　4.1本標(biāo)準(zhǔn)采用間接法計(jì)數(shù)血小板(Platelet，PLT)。即用熒光標(biāo)記PLT后，用流式細(xì)胞儀檢測紅細(xì)胞(Redbloodcell，RBC)和PLT的比值，同時(shí)用單通道阻抗原理的半自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀準(zhǔn)確計(jì)數(shù)RBC，用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT的計(jì)數(shù)值。

　　4.2為了保證參考方法檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，建立參考方法的實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行比對。

　　5、血小板計(jì)數(shù)參考方法的原理

　　首先將EDTA抗凝血標(biāo)本用無菌緩沖液進(jìn)行預(yù)稀釋，再用特定的熒光抗體對PLT進(jìn)行染色。溶液中已染色的血小板被稀釋成計(jì)數(shù)濃度，用流式細(xì)胞儀檢測血小板和紅細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度將閾值設(shè)在可從RBC中區(qū)分PLT的位置，以檢測出RBC和PLT的比值。用RBC的計(jì)數(shù)值除以RBC/PLT的比值計(jì)算出PLT計(jì)數(shù)值。

　　6、血標(biāo)本

　　6.1用合乎要求的塑料注射器或真空采血系統(tǒng)采集健康人的靜脈血標(biāo)本。

　　6.2標(biāo)本的收集要求使用EDTA二鉀為抗凝劑，抗凝劑的濃度為3.7至5.4umol/ml血(1.5～2.2mg/ml血)。

　　6.3盛有標(biāo)本的試管應(yīng)有足夠的剩余空間以便于血標(biāo)本的混勻操作。

　　6.4標(biāo)本中不能有肉眼可見的溶血或小凝塊。

　　6.5標(biāo)本置于18℃～22℃室溫條件下，取血后4小時(shí)之內(nèi)完成檢測。

　　6.6為了保證RBC和PLT分布的均一性，在預(yù)稀釋和加標(biāo)記抗體前動作輕柔地將采血管反復(fù)顛倒，充分混勻標(biāo)本。勿使用混勻器對標(biāo)本進(jìn)行混勻。

　　7、容器和器皿

　　為避免血小板黏附于儲存容器或稀釋器皿上，在標(biāo)本檢測的整個(gè)過程中必須使用聚丙烯或聚苯乙烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。

　　8、儀器的性能

　　8.1使用流式細(xì)胞儀，通過前向角散射光和熒光強(qiáng)度來檢測PLT和RBC.儀器在檢測異硫氰酸熒光素標(biāo)記的直徑為2μm的球形顆粒時(shí)必須有足夠的敏感度。

　　8.2用半自動、單通道、阻抗原理的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測RBC，儀器小孔管的直徑為80～100μm，小孔的長度為直徑的70%至100%，計(jì)數(shù)過程中吸入稀釋標(biāo)本體積的準(zhǔn)確度在1%以內(nèi)(溯源至國家或國際計(jì)量標(biāo)準(zhǔn))。

　　9、試劑

　　9.1稀釋液：用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液，濃度為0.01mol/L，pH值7.2～7.4，含0.1%的牛血清白蛋白(BSA)，配制方法如下：

　　9.1.1將1.15g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4;化學(xué)分析純，;分子量為142.0)加到約750ml去離子水或蒸餾水中并使之溶解。

　　9.1.2向210mg磷酸二氫鉀(KH2PO4;化學(xué)分析純，分子量為136.1)，8.0g氯化鈉(NaCl;化學(xué)分析純，分子量為58.44)，200mg氯化鉀(KCl;化學(xué)分析純，分子量為74.55)和1.0gBSA的混合物中加入去離子水或蒸餾水至1000ml.保存于4℃～8℃條件下。

　　9.1.3用低附著性的平均孔徑在0.20～0.25μm之間的濾膜過濾。

　　9.2染液：使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD41和CD61抗體，這兩種抗體可以與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物結(jié)合，用于檢測血小板。

　　實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確認(rèn)該批號抗體是否能得到足夠的染上熒光的血小板。抗體應(yīng)能得到足夠高的血小板的熒光信號以便通過logFL1(528nm處的熒光強(qiáng)度)對logFS(前向角散射光)的圖形分析，將血小板從噪聲、碎片和RBC中分辨出來。

　　10、檢測過程

　　10.1用加樣器加5μl充分混勻(至少輕柔顛倒標(biāo)本管8次)的血標(biāo)本于100μl已過濾的PBS-BSA稀釋液中。

　　10.2加5μlCD41抗體和5μlCD61抗體染液，在室溫18℃～22℃、避光條件下放置15分鐘。

　　10.315分鐘后，加4.85mlPBS-BSA稀釋液制備成1：1000的稀釋標(biāo)本，輕輕顛倒混勻以保證PLT和RBC充分混勻。

　　10.4用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，應(yīng)至少檢測5000個(gè)信號，其中PLT應(yīng)多于1000.流式細(xì)胞儀的設(shè)定必須保證每秒計(jì)數(shù)少于3000個(gè)信號。如果同時(shí)收集到RBC散射光的信號和血小板的熒光信號應(yīng)被視為RBC-PLT重疊，計(jì)數(shù)結(jié)果將被分別計(jì)入RBC和PLT.

　　直方圖或點(diǎn)圖均可被采用，但推薦使用點(diǎn)圖。檢測過程中推薦使用正向置換移液器。

　　11、RBC濃度的計(jì)數(shù)法

　　據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/TXXX-2003：紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的參考方法。

　　12、血小板計(jì)數(shù)值的確定

　　使用流式細(xì)胞儀確定RBC/PLT的比值

　　R=RBC/PLT

　　用RBC數(shù)除以R值得到PLT計(jì)數(shù)值

　　13、重疊

　　一旦設(shè)定了理想的檢測條件，則不須再次進(jìn)行重疊計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)。

　　14不精密度

　　血小板檢測結(jié)果的不精密度(CV)要求≤3%。