2013藥學(xué)類輔導(dǎo)：乙型肝炎病毒的生物學(xué)性狀

　　(一)形態(tài)與結(jié)構(gòu)

　　1.大球形顆粒：亦稱Dane顆粒，它是一種由一個(gè)囊膜和一個(gè)含有DNA分子的核衣殼組成的病毒顆粒，直徑約42nm。核衣殼為20面體對稱結(jié)構(gòu)。游離的核衣殼只能在肝細(xì)胞核內(nèi)觀察到。血中Dane顆粒濃度以急性肝炎潛伏期后期為最高，在疾病起始后則迅速下降。 Dane顆粒表面含有HBsAg ，核心中還含有雙股有缺口的DNA鏈和依賴DNA的DNA多聚酶。目前認(rèn)為Dane顆粒即完整的HBV。

　　HBV DNA的兩鏈長短不一，長鏈(L)完整，為負(fù)鏈，長度恒定，約3200個(gè)核苷酸。短鏈(S)為正鏈，長度可變，約為長鏈長度的50～100%，鏈的增生按5′-3′順序進(jìn)行。在不同分子中短鏈3′端的位置是可變的，而短鏈和長鏈的5′端位置固定點(diǎn)為粘性末端，通過250～300個(gè)核苷酸堿基配對，以維持DNA分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在粘性末端兩側(cè)，兩鏈5′端各有一個(gè)由11個(gè)bp組成的直接重復(fù)序列(Direct repeat DR)-5′TTCACCTCTCC，該DR位于第1824個(gè)核苷酸者稱DR1，位于第1590個(gè)核苷酸者稱DR2，在病毒復(fù)制中起作用。

　　2.小形球顆粒：直徑約22nm的小球形顆粒是HBV感染后血液中最多見的一種。它由HBsAg，即病毒的囊膜組成�；瘜W(xué)組成為脂蛋白，可按其特有的密度與正常血清蛋白部分分離。在此顆粒中未檢出達(dá)DNA多聚酶活性。目前認(rèn)為HBV的小顆粒不是HBV，可能是它感染肝細(xì)胞時(shí)合成過剩的囊膜而游離于血循環(huán)中。

　　3.管形顆粒：直徑約22nm，長度可在100～700nm之間。實(shí)際上它是一串聚合起來的小顆粒，但同樣具有HBsAg的抗原性。

　　(二)基因結(jié)構(gòu)

　　目前，已可從感染HBV病人的血清中及感染肝臟提純的病毒核心中分離出環(huán)狀雙股DNA，從而確定HBV屬DNA病毒。

　　研究Dane顆粒DNA結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，DNA分子含有約3，200個(gè)核苷酸。它包括兩個(gè)鏈;一個(gè)長度固定的負(fù)鏈和另一長度不定的正鏈。由于DNA生物合成是在多聚酶作用DNA引物生長末端3′-OH與加入的脫氧核苷酸的5'-磷酸基形成磷酸二脂鍵完成的，因此，鏈的增生按5'-3'順序進(jìn)行，而且加到鏈上的每種脫氧核苷酸是按模板DNA的堿基配對互補(bǔ)規(guī)律進(jìn)行，長鏈在1,800或1,818核苷酸附近有一個(gè)制品。短鏈的5'-末端通過長達(dá)250-300個(gè)核苷酸的堿基配對而維持分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。DNA多聚酶作用不斷延長短鏈3′端以修補(bǔ)缺口。缺口可能與HBV的DNA在感染細(xì)胞內(nèi)的整合有關(guān)。

　　目前，由于克隆化DNA完整核苷酸已經(jīng)確定，現(xiàn)已證實(shí)HBsAg和HBcAg都是由Dane顆粒的DNA所編碼，并且二類基因存在同一DNA分子上。有人比較病毒基因編碼能力和病毒多少，發(fā)現(xiàn)HBv DNA負(fù)鏈能編碼全部已知的HBV蛋白質(zhì)，而其正鏈開放讀碼區(qū)，不能編碼病毒蛋白。

　　HBV DNA負(fù)鏈有四個(gè)開放區(qū)，分別稱為S、C、P及X(圖26-2)，能編碼全部已知的HBV蛋白質(zhì)。S區(qū)可分為二部分，S基因和前S基因。S基因(核苷酸155～833)能編碼主要表面蛋白。S基因之前是一個(gè)能編碼163個(gè)氨基酸(2，848-154)的前S基因，編碼Pre S1和Pre S2蛋白。C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼HBeAg和HBcAg。P區(qū)最長，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶。X區(qū)(核苷酸1，374～1，835)可能編碼有154個(gè)氨基酸的堿性多肽，長鏈的裂口位于此區(qū)。

　　(三)HBV的抗原組成

　　1.HBsAg：HBsAg是由HBV的基因組所特定的，為上述三種形態(tài)的顆粒所共有。

　　HBsAg 抗原活性屬于高浮力密度范圍內(nèi)的脂蛋白類。用CsCl密度梯度離心，表面抗原(小顆粒和管狀顆粒)平均密度為1.20g/cm2。Dane顆粒的密度略高，為1.25g/cm2。純化的22nm顆粒的平均沉降系數(shù)為33-54S，分子量約為24-2.5×106。

　　純化的HBsAg 含有類脂質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及糖蛋白。它由8種多肽組成，定名為P1至P8。其中至少有二種或三種多肽過碘酸Schiff試驗(yàn)陽性，提示存在糖類結(jié)構(gòu)。用紫外分光光度計(jì)檢查提取的HBsAg，顯示有典型的蛋白吸收光譜。蛋白占總量的70～90%以上，廣義的HBsAg 由三種蛋白組成：(1)主要表面蛋白(S蛋白，小分子HBsAg)，由S基因編碼的226個(gè)氨基酸組成。(2)中分子蛋白(中分子HBsAg)，由前S2、S基因編碼，在S蛋白226個(gè)氨基酸的N端附加一個(gè)含55個(gè)氨基酸的Pre S2蛋白組成，共281個(gè)氨基酸。(3)大分子蛋白(大分子HBsAg)，由S，前S1和前S2基因編碼，在中分子蛋白281個(gè)氨基酸的N端附加一個(gè)含119個(gè)氨基酸的PreS1蛋白組成，共400個(gè)氨基酸。

　　S蛋白即狹義HBsAg，是HBV囊膜的主要表面抗原的主要成份，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24兩種形式，以二硫鍵相連形成二聚體，代表HBsAg的結(jié)構(gòu)單位，具備完整的抗原性。如二聚體解離，則HBsAg抗原性將會明顯下降。

　　HBsAg 能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體—抗HBS，它是HBV的中和抗體，具有免疫保護(hù)作用，HBsAg的檢出是HBV感染的標(biāo)志之一。

　　前S蛋白2(Pre S2)，的C端HBsAg端相連，Pre S2暴露于HBV囊膜外層，具有多聚人血清白蛋白 (Polymenized Human SerumAlbumin,PHSA)的受體(PHSA-R)，能與PH-SA結(jié)合。由于肝細(xì)胞表面也有PHSA-R，HBV能通過血循環(huán)中存在的PHSA的介導(dǎo)，吸附到肝細(xì)胞表面，最后經(jīng)胞飲作用進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。如病人血清中檢出Pre S2，表示HBV在肝細(xì)胞中復(fù)制。PreS2有良好的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體—抗Pre S2。此抗體出現(xiàn)于急性感染恢復(fù)早期，比抗HBs出現(xiàn)早而維持時(shí)間與抗HBs一樣�？筆reS2具有中和作用，可作為機(jī)體康復(fù)的指標(biāo)之一。

　　Pre S1有較強(qiáng)免疫原性，并能增強(qiáng)Pre S2和HBsAg 的免疫原性;Pre S1刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體—Pre S1。該抗體有l(wèi)gM和lgG兩種，其中抗Pre S1在HBV感染潛伏期，也就是在抗HBV～lgM出現(xiàn)前已產(chǎn)生，故可作為HBV早期感染的特異性指標(biāo)。而抗Pre S1 lgG出現(xiàn)稍晚，在體內(nèi)維持時(shí)間較長，具有中和作用。

　　HBsAg對一些促進(jìn)變性的化合物，如乙醚、1：1氯仿一尿素、十二烷基硫酸鈉、吐溫30以及各種蛋白水解酶都很穩(wěn)定。HBsAg在酸性下孵育幾小時(shí)仍很穩(wěn)定。在堿性下，冷凍融化不能使其滅活。表面的類脂質(zhì)可能對于一些主要由蛋白組成的抗原決定簇起保護(hù)作用。

　　HBsAg具有幾種特異性抗原組分，包括各亞型共同抗原特異決定族a,和二組互相排斥的亞型決定簇d/y和 w/r。HBsAg的主要亞型有adr、adw、ayr及ayw4種。歐美各國adr、為主，我國漢族以adr居多中區(qū)地區(qū)及我國少數(shù)民族地區(qū)以ayw為主(西藏、新疆、內(nèi)蒙等)。

　　2.HBcAg：HBcAg存在于Dane顆粒的核心和乙型肝炎患者的肝細(xì)胞核內(nèi)。HBcAg一般從HBcAg陽性尸檢肝或?qū)嶒?yàn)感染的黑猩猩肝臟提取。在乙型肝炎的急性期、恢復(fù)期和HBcAg攜帶者中�？蓽y出抗～HBc。此抗體對病毒無中和作用。體內(nèi)如發(fā)現(xiàn)HBcAg或抗～HBc表示HBV在肝內(nèi)持續(xù)復(fù)制。

　　3.HBeAg：有關(guān)e抗原的本質(zhì)還不十分清楚，但多數(shù)認(rèn)為它是潛藏存在于Dane顆粒的核心部分。到目前為止，尚未在HbsAg陰性的血清中出現(xiàn)過。HBeAg是一種溶性抗原。抗原已知有三種亞型：e1，e2及e3。由于HBeAg與DNA多聚酶在血液中的消長相符，故HBcAg的存在可作為體內(nèi)有HBV復(fù)制及血清具有傳染性的一種標(biāo)記，血中HBsAg滴度越高，HBeAg的檢出率亦愈高。有些病人可出出現(xiàn)HBe抗體，可能也是一種有保護(hù)作用的抗體。

　　(四)HBV的培養(yǎng)

　　HBV的組織培養(yǎng)尚未成功。雖然近年來發(fā)展了從人胚肝獲得的分化膿細(xì)胞初代培養(yǎng)、制備半連續(xù)人肝細(xì)胞系和診斷性肝穿刺培養(yǎng)的成人胚組織的方法，但應(yīng)用各種肝組織在體外培養(yǎng)HBV仍很困難。盡管用各種細(xì)胞和器官分離HBV的大膽嘗試，獲得一些“肝炎待定”病毒，但難以使其在組織培養(yǎng)中連續(xù)傳代，因而還沒有一個(gè)被公認(rèn)是HBV。近來用提取HBv DNA進(jìn)行傳染及通過細(xì)胞融合來拯救病毒的途徑發(fā)離HBV，仍未得到公認(rèn)的結(jié)果。

　　南非學(xué)者(1976)報(bào)道了從一個(gè)HBsAg陽性原發(fā)性肝癌組織建立的細(xì)胞系(PLC/PRF/5)中找到HBsAg的復(fù)制。此細(xì)胞系的主要特點(diǎn)是能產(chǎn)生HBsAg 逐日上升。104/日細(xì)胞可產(chǎn)生500ng HBsAg ，免疫電鏡顯示大多數(shù)為22nm的顆粒，均為圓形，略有亞微結(jié)構(gòu)。其抗原性與免疫性均與血液中的HBsAg相同。未見有Dane顆粒及管形。目前，此細(xì)胞系已用于體外研究病毒基因組表達(dá)的有用模型。

　　黑猩猩是HBV的易感動物，狨猴雖可感染但不如前者敏感。國外用黑猩猩研究HBV的發(fā)病機(jī)理，檢測自動免疫、被動免疫的效果以及HBV疫苗的安全性。但黑猩猩的來源短缺，難以廣泛應(yīng)用。

　　(五)抵抗力

　　HBV對外界的抵抗力較強(qiáng)。對低溫、干燥、紫外線和一般化學(xué)消毒劑均耐受。乙肝病毒的傳染性和HBsAg的抗原性在對外界抵抗力方面完全一致。二者在37℃活性能維持7天，在-20℃可保存20年，100℃加熱10分鐘可使HBV失去傳染病，但仍可保持表面抗原活性。HBV對0.5%過氧乙酸、5%氯酸鈉和3%漂白粉敏感，可用它們來消毒。