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執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試

2012年公衛(wèi)助理醫(yī)師考試輔導(dǎo):肽的順序分析

  在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定中,肽的順序分析是比較重要的一步。肽的順序分析也有化學(xué)法和酶解法兩種。

  1)化學(xué)法Edman降解法

  這是目前用于順序分析的最主要的方法。它的原理是從N端開始,逐步降解。將肽先與異硫氰酸苯酯(PTH試劑)在pH8-9條件下作用,肽的NH2末端接到異硫氰酸苯酯的C原子上生成苯異硫甲氨酰肽,簡稱PTC肽,在強酸作用下,可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化,肽鍵斷裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一個失去末端氨基酸的肽鏈。此肽不被破壞,因而又可出現(xiàn)一個新的N-末端。重復(fù)以上的步驟,繼續(xù)與PTH試劑作用,繼續(xù)分析,苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有機溶劑抽提出來進(jìn)行鑒定。但此衍生物很不穩(wěn)定,在水中可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)。這些步驟通常稱為Edman氏逐步降解法。所以可用來測定氨基酸的排列順序。Edman降解法的優(yōu)點是樣品用量少,靈敏度高。

  PTH-氨基酸的鑒定可以用各種層析方法,如紙層析、薄層層析、氣相層析和質(zhì)譜法等,現(xiàn)在多用高壓液相層析法。雖然此方法具有很多優(yōu)點,但是由于操作繁瑣,工作量大,所以目前有人根據(jù)Edman降解的原理作一系列改進(jìn)。

  下面簡單介紹幾種方法

  A.1967年Edman及Begg介紹了一種Edman降解的液相自動分析裝置,使順序分析開始走向自動化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄膜,使之固定。然后與PITC試劑反應(yīng)。再用有機溶劑多次抽提除去過剩試劑,因而樣品易丟失,且儀器昂貴,使用受到限制。

  B.1970年Laursen改進(jìn)為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少,檢出靈敏,可分析20?0肽,其原理是將肽共價結(jié)合到惰性支持物上,固定后裝柱再行Edman降解。

  固相順序儀的惰性支持物有:

  此法成功的關(guān)鍵是肽段的固定,目前采用C端α羧基固定法,重復(fù)法高,其中以高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好,固定率可達(dá)90-95%。

  C.另外也有從化學(xué)反應(yīng)的角度考慮,試圖改進(jìn)Edman方法。1976年有人將異硫氰酸苯酯的苯基改變?yōu)榧装迸嫉,試劑為甲氨偶氨苯異硫氰酸鹽(簡稱DABITC)。這是一種有色試劑,產(chǎn)物DABIH氨基酸呈桔黃色,因此鑒定時無需染色,用肉眼即可分辨。此方法靈敏度很高,一次分析小肽段只要幾個nanomole樣品即可,是目前一種很可取的方法。此外也有人將異硫氰酸酯進(jìn)行35S標(biāo)記,使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。

  2)酶解法肽譜重迭法

  分析肽段也可采用酶解法,利用專一性不同的兩種酶將一個肽分別斷裂成更小的寡肽,比較兩種方法所得之肽段的重復(fù)性,進(jìn)行氨基酸順序的裝配。例如,有一個肽段,通過氨基酸組成分析已知其為十肽,假如先以糜蛋白酶水解,則得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析結(jié)果如下:

  Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

  糜蛋白酶水解

  +肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)

  胰蛋白酶水解

  Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val

  將此兩套寡肽可以做分析比較,因為十肽的N末端及C末端已事先測定分別為Ala及Val,因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此類推如下

寡肽號 氨基酸組成部分順序
A-1 Ala·Pha
B-1 Ala·Phe·Gly·Lys
A-2 Gly·Lys·Asn·Tyr
B-2 Asn·Tyr·Arg
A-3 Arg·Trp
B-3 Trp·His·Val
A-4 His·Val
+肽順序 Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val

  水解酶也可運用二肽酶,兩組可用同一種酶水解如第一套肽是A桞,C桪,E桭,G桯……第二套肽水解則先將該肽段N端切去一個末位氨基酸,然后再開始二肽酶斷裂,結(jié)果是A,B桟,D桬,F(xiàn)桮……這樣分析比較也可排列出肽段順序。

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李瑞生老師
在線名師:李瑞生老師
   畢業(yè)于對外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué),熟悉經(jīng)貿(mào)類各種資格考試,培訓(xùn)、輔導(dǎo)過...[詳細(xì)]
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