2012年公衛(wèi)助理醫(yī)師考試輔導(dǎo)：肽的順序分析

　　在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定中，肽的順序分析是比較重要的一步。肽的順序分析也有化學(xué)法和酶解法兩種。

　　1)化學(xué)法�睧dman降解法

　　這是目前用于順序分析的最主要的方法。它的原理是從N端開始，逐步降解。將肽先與異硫氰酸苯酯(PTH試劑)在pH8-9條件下作用，肽的NH2末端接到異硫氰酸苯酯的C原子上生成苯異硫甲氨酰肽，簡稱PTC�搽模�在強(qiáng)酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化，肽鍵斷裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一個(gè)失去末端氨基酸的肽鏈。此肽不被破壞，因而又可出現(xiàn)一個(gè)新的N-末端。重復(fù)以上的步驟，繼續(xù)與PTH試劑作用，繼續(xù)分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有機(jī)溶劑抽提出來進(jìn)行鑒定。但此衍生物很不穩(wěn)定，在水中可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)。這些步驟通常稱為Edman氏逐步降解法。所以可用來測(cè)定氨基酸的排列順序。Edman降解法的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少，靈敏度高。

　　PTH-氨基酸的鑒定可以用各種層析方法，如紙層析、薄層層析、氣相層析和質(zhì)譜法等，現(xiàn)在多用高壓液相層析法。雖然此方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是由于操作繁瑣，工作量大，所以目前有人根據(jù)Edman降解的原理作一系列改進(jìn)。

　　下面簡單介紹幾種方法

　　A.1967年Edman及Begg介紹了一種Edman降解的液相自動(dòng)分析裝置，使順序分析開始走向自動(dòng)化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄膜，使之固定。然后與PITC試劑反應(yīng)。再用有機(jī)溶劑多次抽提除去過剩試劑，因而樣品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。

　　B.1970年Laursen改進(jìn)為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少，檢出靈敏，可分析20?0肽，其原理是將肽共價(jià)結(jié)合到惰性支持物上，固定后裝柱再行Edman降解。

　　固相順序儀的惰性支持物有：

　　此法成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α�掺然�固定法，重復(fù)法高，其中以高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達(dá)90-95%。

　　C.另外也有從化學(xué)反應(yīng)的角度考慮，試圖改進(jìn)Edman方法。1976年有人將異硫氰酸苯酯的苯基改變?yōu)榧装迸嫉�苯，試劑為甲氨偶氨苯�伯惲蚯杷猁}(簡稱DABITC)。這是一種有色試劑，產(chǎn)物DABIH�舶被�酸呈桔黃色，因此鑒定時(shí)無需染色，用肉眼即可分辨。此方法靈敏度很高，一次分析小肽段只要幾個(gè)nanomole樣品即可，是目前一種很可取的方法。此外也有人將異硫氰酸酯進(jìn)行��35S標(biāo)記，使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。

　　2)酶解法�搽淖V重迭法

　　分析肽段也可采用酶解法，利用專一性不同的兩種酶將一個(gè)肽分別斷裂成更小的寡肽，比較兩種方法所得之肽段的重復(fù)性，進(jìn)行氨基酸順序的裝配。例如，有一個(gè)肽段，通過氨基酸組成分析已知其為十肽，假如先以糜蛋白酶水解，則得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析結(jié)果如下：

　　Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

　　糜蛋白酶水解

　　+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)

　　胰蛋白酶水解

　　Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val

　　將此兩套寡肽可以做分析比較，因?yàn)槭�肽的N末端及C末端已事先測(cè)定分別為Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此類推如下

　　水解酶也可運(yùn)用二肽酶，兩組可用同一種酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解則先將該肽段N�捕饲腥ヒ粋�(gè)末位氨基酸，然后再開始二肽酶斷裂，結(jié)果是A，B桟，D桬，F(xiàn)桮……這樣分析比較也可排列出肽段順序。