第 1 頁:第一節(jié) 薄層色譜法 |
第 2 頁:第二節(jié) 氣相色譜法和高效液相色譜法 |
第 3 頁:第三節(jié) 電泳法 |
第二節(jié) 氣相色譜法和高效液相色譜法
掌握氣相色譜法和高效液相色譜法的基本原理;色譜系統(tǒng)適用性試驗的主要內(nèi)容;氣相色譜法和高效液相色譜法在藥物鑒別、檢查和含量測定中的應(yīng)用。了解氣相色譜儀和高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)。
一、氣相色譜法: 以氣體為流動相的色譜法,具有分離效能高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點,不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分析。
(一)基本原理
1.基本概念
色譜峰參數(shù):峰高或峰面積(用于定量),峰位(保留值表示,用于定性),峰寬(用于衡量柱效)
保留值:保留時間、死時間、調(diào)整保留時間
峰寬:標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬、峰寬
2.塔板理論:把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程,分解為間歇的在單個塔板中的分配平衡過程
理論塔板數(shù) n=5.54(tR/Wh/2)2
色譜柱的理論塔板數(shù)越多,柱效越高;同樣長度中塔板高度越小,柱效越高。
3.速率理論:主要說明使色譜峰擴張而降低柱效的因素
范氏方程 H=A+B/μ+Cμ
A為渦流擴散項。采用適當(dāng)粒度、均勻的填料并填充均勻可減小渦流擴散,開管毛細(xì)管柱A=0
B為縱向擴散系數(shù)。為減小縱向擴散可采用較高的載氣流速;或選擇分子量大的重載氣;也可降低柱溫。
C為傳質(zhì)阻抗系數(shù)。在能完全覆蓋載體表面的前提下,應(yīng)適當(dāng)減少固定液用量。
范氏方程說明填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、載氣流速、柱溫、固定液層厚度對柱效的影響。
(二)氣相色譜儀
1.氣源:FID常用載氣多為氮氣或氦氣;TCD多用氦氣或氫氣為載氣;ECD多用氮氣或氬氣
2.進(jìn)樣及汽化系統(tǒng)
3.色譜柱和柱溫箱
4.檢測器
熱導(dǎo)檢測器TCD:濃度型檢測器。構(gòu)造簡單、測定范圍廣、樣品不破壞,但靈敏度較低。
電子捕獲檢測器ECD:靈敏度高、選擇性好。對無電負(fù)性基團的化合物響應(yīng)低。
氫離子火焰檢測器FID:質(zhì)量型檢測器。靈敏度高、響應(yīng)快、線性范圍寬,最常用。
(三) 應(yīng)用 1.鑒別:利用保留值進(jìn)行鑒別。
2.檢查
(1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)含量
(2) 外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量
(3) 加校正因子的主成分自身對照法
(4) 不加校正因子的主成分自身對照法
(5) 面積歸一化法:一般不用于微量雜質(zhì)檢查
3.含量測定:外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法
內(nèi)標(biāo)物要求:①原樣品中不含有的組分;②保留時間與待測組分相近,但能完全分離;③純度合乎要求。
二、高效液相色譜法
(一)速率理論:高效液相色譜法中影響柱效主要因素為渦流擴散項和傳質(zhì)阻抗項。由于液體黏度比載氣大得多,而且柱溫多為室溫,其縱向擴散項很小,可忽略不計。范氏方程簡化為 H=A +Cμ
(二) 高效液相色譜儀: 1.高壓輸液泵 2.色譜柱:分析型和制備型 3.進(jìn)樣閥 4.檢測器:①固定波長檢測器;②可變波長檢測器;③光二極管陣列檢測器
(三)應(yīng)用:與氣相色譜法相似
三、色譜系統(tǒng)適用性試驗方法
1.理論塔板數(shù):不得低于各品種項下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)
2.分離度:除另有規(guī)定外,分離度應(yīng)大于1.5
3.重復(fù)性:取各品種項下對照品2連續(xù)進(jìn)樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%
4.拖尾因子:除另有規(guī)定外,拖尾因子應(yīng)在0.95~1.05之間
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