2012年臨床醫(yī)師內(nèi)科學輔導：急性胰腺炎與細胞凋亡

　　細胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細胞自主地有序死亡，又稱程序性細胞死亡，是一種消滅不需要的和損害的細胞的生命調(diào)控過程。凋亡細胞形成凋亡小體很快被臨近的細胞所吞噬，其特點是不引起炎癥反應。機體以犧牲少部分細胞為代價換取整體的生存與穩(wěn)定。急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)的發(fā)病機制尚未完全清楚，激活的胰蛋白酶對胰腺實質(zhì)的自身消化是AP發(fā)生的重要病理過程。近年來，人們已注意到急性水腫型胰腺炎的胰腺中存在著較多的凋亡細胞，而急性壞死型胰腺炎(acutenecrotizingpancreatitis，ANP)卻很少出現(xiàn)凋亡細胞。這就提示細胞凋亡在AP的發(fā)生和發(fā)展過程中起著一定作用。

　　一、細胞凋亡的概念和檢測方法

　　細胞凋亡在生命過程中具有重要的生物學意義，它嚴格控制著細胞死亡和增殖的平衡。細胞凋亡的產(chǎn)生大體是細胞表面分子接受到誘導因子刺激后將信號傳入細胞內(nèi)部，觸發(fā)了細胞內(nèi)部的遺傳機制，激活了核酸內(nèi)切酶，使細胞染色質(zhì)DNA降解。核酸內(nèi)切酶的活性依賴細胞內(nèi)高濃度的鈣離子，鈣離子達到最高水平的時間需要30～90min，細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是細胞發(fā)生調(diào)亡的一個重要條件。細胞凋亡過程中有一系列特征性的形態(tài)學、生物化學、細胞學及分子生物學方面的改變。其中最重要的特征之一就是凋亡細胞染色體基因組的片段化，是由依賴鈣離子的核酸內(nèi)切酶催化的，這種核酸內(nèi)切酶的性質(zhì)尚不清楚，但作用是十分肯定的。核酸內(nèi)切酶將核小體間的連接部位切割成單鏈DNA片段，這種DNA片段的斷裂不是隨機的，而是185bp的倍數(shù)，這種片段化在瓊脂糖電泳中表現(xiàn)為特殊的云梯狀帶型，據(jù)此可初步確定細胞凋亡的存在。細胞凋亡時染色體DNA會產(chǎn)生單鏈切口，因此設計了原位切口翻譯及標記技術(shù)。凋亡細胞的細胞膜通透性增加，小分子DNA片段丟失，可用流式細胞術(shù)技術(shù)檢測。

　　1.形態(tài)學上的改變：胰腺炎時的胰腺凋亡細胞主要表現(xiàn)為有完整的細胞膜、胞核固縮、凋亡小體形成，線粒體和酶原顆粒完整。由于核小體DNA破裂成碎片，同焦點激光掃描顯微鏡觀察到各種各樣的三維結(jié)構(gòu)。

　　2.端口標記檢測(triphosphate-biotinnick-endlabeling，TUNEL)：TUNEL廣泛用于檢測DNA碎片片段，該方法具有操作簡單、結(jié)果特異性強、重復性好，特別對于低水平凋亡檢測更敏感。kimura等用切除雙側(cè)腎上腺的大鼠誘導胰腺炎，采用半薄及超薄結(jié)構(gòu)模式實施TUNEL和同焦點激光掃描顯微鏡檢查，細胞凋亡的陽性結(jié)果是一致的。但在結(jié)扎胰膽管的模型中用TUNEL檢測不出凋亡細胞，說明不同方式誘導出的胰腺炎模型對檢測結(jié)果有影響。

　　3.流式細胞術(shù)(flowcytometry);發(fā)生凋亡的細胞在細胞學上有一系列特征性改變，所有這些有別于壞死等其它類型細胞死亡的特征都能利用流式細胞術(shù)技術(shù)進行研究，該技術(shù)即能為細胞是否發(fā)生凋亡提供客觀依據(jù)，還能對細胞凋亡進行定量分析，因此它是研究影響細胞凋亡因素及作用機制的一種簡單可行的方法。

　　二、細胞調(diào)亡與胰腺壞死的關系

　　在臨床上，70%以上的AP為水腫型，壞死型胰腺炎中胰腺的壞死程度也存在著很大差異，多數(shù)為輕、中度壞死，僅少數(shù)患者迅速發(fā)展為大面積的或全胰壞死。很顯然，AP發(fā)生后，最終相差懸殊的結(jié)果與多種因素有關，諸如致病原因、胰腺解剖的個體差異、胰腺本身的應激反應程度等。眾所周知，不論何種胰腺炎，激活的胰蛋白酶對胰實質(zhì)的自身消化是其共同途徑，胰腺腺泡細胞的破壞程度與病變程度呈平行關系，那么什么因素進一步影響或制約著胰蛋白酶對胰實質(zhì)的自身消化過程呢?很可能機體內(nèi)存在著由基因控制的一種或多種調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)因子的作用之一就是調(diào)控了胰腺細胞的細胞凋亡，細胞凋亡程度影響著胰腺的壞死程度。1995年Kaiser等用4種不同方法誘導了鼠的ANP模型和1種水腫型胰腺炎模型，在每一種ANP模型中都出現(xiàn)了大量的壞死胰腺細胞，卻很少有凋亡細胞;而水腫型胰腺炎僅有少量壞死細胞，卻有大量凋亡細胞。據(jù)此，Kaiser等認為之所以發(fā)生ANP是沒有細胞凋亡出現(xiàn)，水腫型胰腺炎未向壞死型發(fā)展是由于凋亡細胞對腺泡細胞具有保護作用。Saluja等用動物實驗也證明了相似的觀點，先用缺乏膽堿的飼料喂養(yǎng)小鼠，誘發(fā)出水腫型胰腺炎，然后用含膽堿的飼料喂養(yǎng)小鼠使其胰腺炎得以恢復，這樣就可以誘發(fā)鼠胰腺腺泡細胞的凋亡，再向小鼠腹腔內(nèi)注入大劑量的蛙皮素誘發(fā)AP，與對照組相比，血淀粉酶等生物化學指標差異無顯著意義，但胰腺壞死程度卻明顯減輕。預先誘發(fā)的細胞凋亡能防止胰腺腺泡的損傷，減少ANP的發(fā)生。環(huán)乙酰亞胺能抑制核酸內(nèi)切酶的活性，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。在結(jié)扎大鼠胰膽管的胰腺炎模型中應用環(huán)乙酰亞胺，與對照組相比ANP發(fā)生率明顯增高。這一結(jié)果從另一角度證明細胞凋亡影響著胰腺的病變程度。但是，腺泡細胞過度凋亡會加重胰腺的損害。反復發(fā)作的慢性胰腺炎患者極少發(fā)展為ANP，ANP多為初次發(fā)病，這是人所共知的問題。是否慢性胰腺炎患者胰腺存在較多的凋亡細胞?凋亡細胞如何產(chǎn)生?產(chǎn)生時間、如何作用等都是需要進一步研究的問題。

　　三、細胞調(diào)亡的調(diào)控與胰腺炎的防治

　　細胞調(diào)亡是由基因控制的，在鼠的AP中，PC3/TIS21/BTG2基因是控制胰腺細胞調(diào)亡的重要基因。AP時細胞凋亡基因水平調(diào)控的研究很少，研究多集中在細胞因子上。AP病程中出現(xiàn)大量中性粒細胞的浸潤及巨噬細胞的形成，產(chǎn)生了大量的細胞因子，如：腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，TNFα)、血小板激活因子(platelet-activatingfactor，PAF)及白介素等。這些細胞因子除參與內(nèi)毒素血癥形成外，還具有誘導、調(diào)控胰腺細胞凋亡的作用。其作用方式是多種多樣的，依劑量及產(chǎn)生作用的時間不同，結(jié)果也完全不同。

　　1.TNFα：TNFα與細胞凋亡的關系很密切，它可以誘導CD28分子的轉(zhuǎn)基因表達而導致細胞凋亡;能誘導免疫缺陷病毒慢性感染的貓成纖維細胞發(fā)生細胞凋亡。在體外培養(yǎng)孵育的單個胰腺細胞，TNFα可通過胞膜上TNFα受體的55及75引起反應，形成NE-KappaB易位至細胞核誘發(fā)單個胰腺細胞凋亡。TNFα增加糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄和受體的數(shù)量，影響蛙皮素誘導的鼠胰腺炎的細胞調(diào)亡。在蛙皮素誘導的胰腺炎中應用TNFα拮抗劑，抑制了胰腺細胞凋亡。脂多糖是革蘭陰性細菌細胞膜的主要成分，用蛙皮素誘導鼠胰腺炎前，腹腔注入小劑量脂多糖(50　μg/kg)能誘導胰腺腺泡細胞調(diào)亡，減輕胰腺病變程度。其細胞調(diào)亡可能是通過TNFα誘導的。上述結(jié)果說明TNFα能誘導單個胰腺細胞和實驗性胰腺炎的細胞凋亡。AP時，尤其是ANP早期即產(chǎn)生了大量的TNFα，在動物實驗和臨床都已證實TNFα明顯增高會誘發(fā)內(nèi)毒素血癥、引發(fā)多器官功能障礙綜合征，但此時TNFα并沒有對胰腺起到保護作用，合理的解釋是：ANP發(fā)生后，機體發(fā)生了劇烈地炎癥反應，誘導細胞凋亡是一復雜過程，產(chǎn)生過量的TNFα對機體的損害大于保護作用。所以，TNFα如何誘導胰腺炎時胰腺細胞凋亡及其誘導過程等都是需要進一步研究的問題。

　　2.中性粒細胞、PAF：中性粒細胞、PAF在AP的病理過程中起著重要作用。在蛙皮素誘導的胰腺炎，PAF是由胰腺腺泡細胞或?qū)Ч芗毎�產(chǎn)生的，PAF具有活化中性粒細胞的功能。激活的中性粒細胞通過釋放過氧化氫、一氧化氮等物質(zhì)誘導細胞壞死或細胞凋亡而導致細胞死亡。在蛙皮素誘導的鼠胰腺炎，中性粒細胞可以轉(zhuǎn)變凋亡細胞為壞死細胞，從靜脈用抗中性粒細胞血清后，凋亡細胞增加而壞死細胞減少。同樣在蛙皮素誘導的鼠胰腺炎，腹腔注入甲氨蝶呤抑制中性粒細胞的活性，與對照組相比細胞凋亡數(shù)增加了兩倍，減輕了胰腺的損害。PAF具有雙重作用，既能調(diào)節(jié)腺胞細胞凋亡，又能增強中性粒細胞的趨化性。用PAF拮抗劑(BN52021)治療用蛙皮素誘導的鼠胰腺炎既減少了細胞凋亡，也減少了細胞壞死。

　　3.p53的過度表達及臨床意義：p53的生物化學功能是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細胞的G1期監(jiān)視細胞基因組的完整性。如果DNA遭到破壞，p53蛋白與之結(jié)合，直到損壞的DNA得到修復。如果修復失敗，便有效地誘發(fā)細胞凋亡。在59%的胰腺炎患者和67%的胰腺癌患者中均有p53的過度表達。p53的過度表達是胰腺癌的標志物，同時也意味著存在慢性胰腺炎，所以不具有特異性。在慢性胰腺炎的DNA片段中存在著野生型p53，野生型p53是DNA損傷的細胞發(fā)生細胞凋亡時必不可少的信號，它使損傷的胰腺細胞進入G1期進行修復，并誘導不能修復的損傷細胞發(fā)生凋亡而不引起炎癥反應。這為慢性胰腺炎反復發(fā)作卻很少發(fā)生為ANP提供了一定的依據(jù)。其它的基因如：bcl-2、c-myc對胰腺炎時細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用尚在研究中。

　　總之，適度的細胞凋亡對AP時的胰腺腺胞細胞具有保護作用，炎癥因子誘導細胞凋亡表現(xiàn)為雙重作用。亞細亞蒿素(artemisiaasiatica)能誘導胰腺細胞凋亡而減輕實驗性胰腺炎的病變程度，是目前唯一被證實是通過誘導胰腺細胞凋亡來治療AP的藥物。臨床上尚無AP時細胞凋亡的研究報道，內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素能降低胰腺的壞死程度，地塞米松、中藥已用于治療ANP患者，這些藥物是否能誘導胰腺細胞調(diào)亡，需要進一步研究。目前，能闡述細胞凋亡對人胰腺炎的發(fā)展有影響的方法是：用已有的急慢性胰腺炎臘塊標本，利用TUNEL檢測凋亡細胞數(shù)量。但是，這項工作需要多家協(xié)作才能完成。

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