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甲氧基測(cè)定法
儀器裝置
A為50ml圓底燒瓶，側(cè)部具一內(nèi)徑為1mm的支管供導(dǎo)入二氧化碳或氮?dú)饬饔?瓶頸垂直裝有長(zhǎng)約25cm、內(nèi)徑為9mm的直形空氣冷凝管E，其上端彎曲成出口向下、并縮為內(nèi)徑2mm的玻璃毛細(xì)管，浸入內(nèi)盛水約2ml的洗氣瓶B中;洗氣瓶具出口為一內(nèi)徑約7mm的玻璃管，其末端為內(nèi)徑 4mm可拆卸的玻璃管，可浸入兩個(gè)相連接的接受容器C、D中的第一個(gè)容器C內(nèi)液面之下。
測(cè)定法
取干燥的供試品(相當(dāng)于甲氧基 10mg)，精密稱定，置燒瓶中，加熔融的苯酚2.5ml與氫碘酸5ml，連接上述裝置;另在兩個(gè)接受容器內(nèi)，分別加入10%醋酸鉀的冰醋酸溶液6與 4ml，再各加溴0.2ml;通過(guò)支管將CO2或N2氣流緩慢而均衡地(每秒鐘1～2個(gè)氣泡為宜)通入燒瓶，緩緩加熱使溫度控制在恰使沸騰液體的蒸氣上升至冷凝管的半高度(約至30分鐘使油液溫度上升至135～140℃)，在此溫度下通常在45分鐘可完成反應(yīng)(根據(jù)供試品的性質(zhì)而定， 如果供試品中含有多于二個(gè)甲氧基時(shí)，加熱時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)到1～3小時(shí))。而后拆除裝置，將兩只接受器的內(nèi)容物傾入250ml碘瓶(內(nèi)盛25%醋酸鈉溶液 5ml)中，并用水淋洗使總體積約為125ml，加入甲酸0.3ml，轉(zhuǎn)動(dòng)碘瓶至溴的顏色消失，再加入甲酸0.6ml，密塞振搖，使過(guò)量的溴完全消失，放置1～2 分鐘，加入碘化鉀1.0g與稀硫酸5ml，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于0.5172mg的甲氧基。
肝素生物檢定法
本法系比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)延長(zhǎng)新鮮兔血或兔、豬血漿凝結(jié)時(shí)間的作用，以測(cè)定供試品的效價(jià)。
標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
精密稱取肝素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按標(biāo)示效價(jià)加滅菌水溶解使成每1ml中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內(nèi)，4～8℃貯存，如無(wú)沉淀析出，可在3個(gè)月內(nèi)使用。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制
試驗(yàn)當(dāng)日，精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組(ds<[3]>、ds<[2]>、ds<[1]>)用 0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值(r)應(yīng)相等。調(diào)節(jié)劑量使低劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間較不加肝素對(duì)照管組明顯延長(zhǎng)。高劑量組各管的平均凝結(jié)時(shí)間，用新鮮兔血者，以不超過(guò)60分鐘為宜，其稀釋液一般可配成每1ml中含肝素2～5單位，r為1：0.7左右;用血漿者，以不超過(guò)30分鐘為宜，其稀釋液一般可配成每1ml中含肝素0.5～1.5單位，r為1∶0.85左右。
供試品溶液與稀釋液的配制
按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)(A<[T]>)，照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低(dT<[3]>、dT<[2]>、 dT<[1]>)三種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值(r)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相等，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品各劑量組的凝結(jié)時(shí)間應(yīng)相近。
血漿的制備
迅速收集兔或豬血置預(yù)先放有8%枸櫞酸鈉溶液的容器中，枸櫞酸鈉溶液與血液容積之比為1：19，邊收集邊輕輕振搖，混勻，迅速離心約20分鐘(離心力不超過(guò)1500×g為宜，g為重力常數(shù))。立即分出血漿，分成若干份分裝于適宜容器內(nèi)，低溫凍結(jié)貯存。臨用時(shí)置37±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過(guò)濾，使用過(guò)程中在4～8℃放置。
檢定法
(1)新鮮兔血
取管徑均勻(0.8×3.8cm或1.0×7.5cm)、清潔干燥的小試管若干支，每管加入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液0.1ml，每種濃度不得少于3管，各濃度的試管支數(shù)相等。取剛抽出的兔血適量，分別注入小試管內(nèi)，每管0.9ml，立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并開始計(jì)算時(shí)間。將小試管置37±0.5℃恒溫水浴中，從動(dòng)物采血時(shí)起至小試管放入恒溫水浴的時(shí)間不得超過(guò) 3分鐘，注意觀察并記錄各管的凝結(jié)時(shí)間。
(2)血漿
取上述規(guī)格的小試管若干支，分別加入血漿一定量，置37±0.5℃恒溫水浴中預(yù)熱5～10分鐘后，依次每管加入一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液及1%氯化鈣溶液(每種濃度不得少于3管，各濃度的試管支數(shù)相等)，血漿、肝素稀釋液和氯化鈣溶液的加入量分別為0.5、0.4和0.1ml(或0.8、0.1和0.1ml)，加入氯化鈣溶液后，立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并開始計(jì)算時(shí)間，注意觀察并記錄各管凝結(jié)時(shí)間。將各管凝結(jié)時(shí)間換算成對(duì)數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(附錄ⅩⅣ)中的量反應(yīng)平行線測(cè)定法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。
檢定法(1)的可信限率(FL%)不得大于10%。
檢定法(2)的可信限率(FL%)不得大于5%。
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